糞便基因組DNA快速提取試劑he（離心柱型）
常規(guī)的DNA純化方式并不能有效地去除糞便中存在的大量抑制因子而導致下游實驗的失敗，如PCR不能擴增出所需片段。該試劑盒采用DNA吸附柱和新型du特的溶液系統(tǒng)，能有效去除動物糞便中各種影響下游實驗（如PCR）的抑制因子，并能高效地回收糞便中的基因組DNA。糞便基因組DNA快速提取試劑he（離心柱型）
糞便基因組DNA快速提取試劑he（離心柱型）
糞便基因組DNA快速提取試劑he（離心柱型）
目錄號：40213
目錄編號 | 包裝單位 |
40213-50 | 50次 |
v 適用范圍：
適用于快速提取各種糞便DNA
v 試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性：
試劑盒組成 | 保存 | 50次 |
緩沖液ASL | 室溫 | 70ml |
雜質(zhì)清除劑AB | 室溫 | 5ml |
結合液CB | 室溫 | 11 ml |
抑制物去除液IR | 室溫 | 25 ml |
漂洗液WB | 室溫 | 15 ml 第一次使用前按說明加指ding量乙醇 |
洗脫緩沖液EB | 室溫 | 15 ml |
蛋白酶K fen（可選） 20mg/ml | 室溫 | 20mg |
吸附柱AC | 室溫 | 50個 |
收集管（2ml） | 室溫 | 50個 |
本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。
雜質(zhì)清除劑AB，短時間內(nèi)使用可以放室溫，長期保存負-20℃。
儲存事項:
1. 緩沖液ASL或者結合液CB低溫時可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在70℃水浴幾分鐘幫助重新充分溶解，恢復澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
2. 雜質(zhì)清除劑AB常溫運輸，短期一個月內(nèi)可4℃存放，-20℃長期保存。
3. 為避免降低活性，方便運輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入1毫升滅菌水溶解，因為反復凍融可能會降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分裝凍存，－20℃保存。
4. 避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。
v 產(chǎn)品介紹：
常規(guī)的DNA純化方式并不能有效地去除糞便中存在的大量抑制因子而導致下游實驗的失敗，如PCR不能擴增出所需片段。該試劑盒采用DNA吸附柱和新型du特的溶液系統(tǒng)，能有效去除動物糞便中各種影響下游實驗（如PCR）的抑制因子，并能高效地回收糞便中的基因組DNA。動物糞便樣品經(jīng)特殊緩沖液ASL重懸后，70℃處理5分鐘裂解細菌；離心去除不溶解的雜質(zhì)，蛋白酶K消化進一步去除蛋白和雜質(zhì)；然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。
v 產(chǎn)品特點：
1. 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進口*公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯fen等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
3. 快速，簡捷，單個樣品操作一般可在40分鐘內(nèi)完成。
4. 多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應。
v 注意事項：
1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達到13,000rpm的傳統(tǒng)臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。
2. 開始實驗前將需要的水浴先預熱到70℃?zhèn)溆谩?/span>
3. 結合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
4. 洗脫液EB不含有螯合劑EDTA， 不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫， 但應該確保pH大于7.5， pH過低影響洗脫效率。用水洗脫DNA應該保存在－20℃。DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。
5. PCR可能被過量的DNA（一般大于1μg）抑制，使用最小用量的洗脫DNA（適當稀釋）反而可以得到更好的擴增。一般加入的洗脫DNA體積不要超過總PCR反應體積的10％。我們建議在PCR反應體系中加入終濃度0.1 μg/μl的BSA（牛血清白蛋白）有助于得到優(yōu)良擴增效果。
v 操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
提示：第一次使用前請先在15ml漂洗液WB中加入60ml無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!
1. 收集約200-220mg糞便到一個2ml離心管，置冰上。
如果是冰凍的標本，加入緩沖液ASL前不能解凍，否則DNA容易降解。
2. 加1.4ml 緩沖液ASL，連續(xù)渦旋振蕩1分鐘或者直到wan全混勻均一。
注意wan全渦旋混勻，否則會嚴重降低產(chǎn)量。
3. 將重懸物70℃溫育5分鐘。
該加熱步驟可以提高3-5倍DNA產(chǎn)量，并且?guī)椭呀饧毦图纳x。對于某些難裂解的細胞（如革蘭氏陽性菌）可以提高到95℃。
4. 渦旋振蕩15秒，室溫放置1分鐘。最高速離心1分鐘沉淀糞便顆粒。
5. 轉(zhuǎn)移900μl上清到一個1.5ml離心管，加入100μl雜質(zhì)清除劑AB，立刻渦旋振蕩1分鐘或者直到wan全混勻均一，室溫放置1分鐘。最高速離心3分鐘去除雜質(zhì)。
6. 轉(zhuǎn)移所有上清到一個1.5ml離心管，最高速離心3分鐘。
7. 轉(zhuǎn)移210μl上清到一個1.5ml離心管，加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，加入200μl 結合液CB，渦旋振蕩15秒，充分混勻。70℃溫育10分鐘。
如果產(chǎn)量偏低，可以轉(zhuǎn)移更多的上清，并且相應的按比例提高蛋白酶K和結合液的和后面的異丙醇使用量。
8. 冷卻后加入100μl 異丙醇，渦旋混勻。
9. 將上一步所得溶液和可能出現(xiàn)的沉淀都加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。
10. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。
11. 加入700μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
12. 加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
13. 將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。
14. 取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100－150μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液可事先在 65-70℃水浴中預熱）， 室溫放置2分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是最小體積不應少于50μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。
15. DNA可以存放在2-8℃，如果要長時間存放，可以放置在－20℃。
v 問題與解決方法:
問題 | 評論與建議 |
洗脫液沒有 DNA或者產(chǎn)量低 | *樣品儲存不當-建議：樣品應該儲存在4℃或者－20℃ *在緩沖液ASL中渦旋勻漿不充分-建議：樣品在ASL中充分的渦旋直到均一。 *和結合液CB混勻不充分-建議：上清和結合液CB立即充分間斷渦旋混勻。 *上離心柱前忘記加異丙醇-建議：記住加異丙醇 * DNA洗脫不充分-建議：洗脫前在室溫放5分鐘 *第一次使用前，漂洗液WB中忘記加無水乙醇-建議：在漂洗液WB中加入指ding量無水乙醇。 |
A260/A280 比值異常高 | *殘留RNA過高-建議：洗脫緩沖液加RNase A，室溫10-30分鐘。 |
DNA下游 反應不正常 | * BSA沒有加到PCR反應體系-建議：PCR反應體系中加入終濃度0.1 μg/μl的BSA。 *下游反應中使用的DNA過量了-建議：假如DNA使用太多，可能會抑制PCR反應，因此可減少洗脫DNA使用量 *非特異性擴增條帶-建議：洗脫液中目的DNA量太低，背景DNA過高，可以考慮使用熱啟動PCR聚合酶 *某些目的細胞裂解困難，不充分導致產(chǎn)量低-建議：可以把裂解液溫育時間提高到95℃ *沒有足夠DNA洗脫下來-建議：查看上面可能的原因 |
最初的離心步驟 第4步驟后沒有 見到多少上清 | *離心力不夠-建議：可以嘗試14000rpm離心5分鐘 |
糞便基因組DNA快速提取試劑he（離心柱型）
